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　　在细胞中，除MRNA外，还存在着大量的非编码RNANCRNA。那些长度介于20～500NT的NCRNA又被称为小分子非编码RNASNMRNA，它们可能以结构或调控分子的形式在多种细胞过程中发挥重要的生物学功能。在多种模式生物中大规模的筛选和鉴定SNMRNA，对于研究其分子种类、结构与功能以及基因进化规律具有重要意义。贾第虫是一种有鞭毛的原生生物，在分类地位上介于原核和真核生物之间，因此成为重要的单细胞真核模式生物。系统研究其SNMRNA，不仅对于深入了解贾第虫细胞RNA的信息具有重要意义，还有可能为研究某些SNMRNA的基因进化规律提供重要线索。本研究采用实验RNA组学与计算机RNA组学相结合的方法，首次对贾第虫的BOXH／ACASNORNA进行了系统研究，并在贾第虫中筛选到8种BOXH／ACASNORNA候选分子。NORTHEM杂交、RTPCR和BLAST分析结果表明这些候选基因中，有7种是首次鉴定的贾第虫BOXH／ACASNORNA。这些SNORNA中绝大部分的分子长度介于100～130M之间，3’末端都含有保守的“ACA”元件。值得注意的是，绝大多数分子中央部位的“H”元件并不保守，以“ANANNN”的形式存在“N”替代任何一种核苷酸。新鉴定的这些SNORNA都可以形成典型的“双茎环”二级结构。虽然本文针对“单茎环”BOXH／ACASNORNA的典型特征也构建了相应的特异性EDNA文库，但并没有筛选到相应的候选基因。因此在贾第虫中，该类SNORNA极有可能只存在“双茎环”这一种二级结构形式。功能分析结果表明，新鉴定的GLSRL8、GLSRL9、GLSR21、GLSR24和GLSR25分别指导贾第虫23SRRNA上U2345、U1801、U45、U1753和U2396的假尿嘧啶化修饰。而GLSR22和GLSR23在贾第虫中没有找到相应的靶分子，属于功能未知的“ORPHAN”SNORNA，表明贾第虫BOXH／ACASNORNA也具有功能的多样性。基因组定位分析结果表明，新鉴定的BOXH／ACASNORNA均由单拷贝基因编码并位于不编码蛋白质的基因间隔区中，而且遵循一个间隔区只含有一个SNORNA的原则。但是，GLSR18与此前发现的BOXC／DSNORNAGLSR17位于同一间隔区中并具有相同的转录方向，NORTHEM分析表明它们是由同一转录前体加工成熟的，这是在贾第虫中首次发现的SNORNA杂合基因簇。在本研究中，还同时构建了TINYRNA的非特异性CDNA文库，对贾第虫的TINYNONCODINGRNATNCRNA进行了筛选和分类，并对内源性SIRNA介导的反转座子基因沉默机制进行了初步研究。对贾第虫15～30NT长的TINYRNA非特异性CDNA文库进行测序和筛选，共获得44个TNCRNA分子，其中TNCRL～TNCR11全部都是反义小分子RNA，根据靶基因的不同可将其分为两类。第一类是反转座子相关的TNCRNATNCRL～TNCR3，它们分别与贾第虫GILM和GILT反转座子的3’UTR互补。这些TNCRNA与线虫中发现的TCLSIRNA非常相似，提示在贾第虫中很可能还存在着更多类似的TNCRNA。与此不同，另外一类是MRNA相关的TNCRNATNCR4～TNCR11，它们与预测的靶MRNA基因都有15～22NT的互补配对，而且靶位点绝大部分都位于MRNA的开放读码框中央区域。这些TNCRNA与在植物和线虫中发现的仅与MRNA降解有关的内源性反义小分子RNA非常相似，很可能在转录后水平调控贾第虫中相关MRNA的基因沉默。利用NORTHERN杂交分析，发现在贾第虫中存在着18～23NT和28～30NT两种不同长度的反转座子相关的TNCRNA。这些TNCRNA表达丰度很低，并且都只与反转座子GILM和GILT的3’UTR有关，而与蛋白质编码区无关。DNA甲基化实验发现，GIIM和GILT反转座子的大部分DNA序列包括全部蛋白质编码区和3’UTR5’端部分区域都被高度甲基化，而3’UTR的3’端则没有被甲基化。分析线虫、植物和四膜虫中己发现的内源性SIRNA的特征，在贾第虫中检测到的这些TNCRNA很可能就是内源性的反转座子SIRNA，并在转录和转录后两个水平同时调控GILM和GILT反转座子的基因沉默，以维持基因组的稳定性。在本研究中，还意外的发现了大量长度集中在17～21NT、来源于多种不同的成熟TRNA的TINYRNA。这些分子中的绝大部分来源于成熟TRNA的3’末端部位，而且其丰度要远高于来源于其它部位的TINYRNA。分析发现，在多种不同的成熟TRNA分子中存在多个相似的切割位点，并且主要位于TC100P和TCSTEM中保守甲基化修饰位点附近。用由17种成熟TRNA特异性的DNA混合探针进行NORTHEM分析，发现这些TRNADERIVEDTINYRNA在细胞中稳定存在。这表明在贾第虫细胞正常生长过程中，某些核酸内切酶在体内特异性的识别这些位点，并将成熟TRNA进一步剪切加工成为大小相对均一的TINYRNA。对贾第虫BOXH/ACASNORNA的研究表明，实验RNA组学与计算机RNA组学方法结合使用能有效发挥各自的优势，并大大提高鉴定SNORNA的效率。与分类地位临近的古细菌、锥虫、以及眼虫中已发现的同类分子相比，贾第虫BOXH/ACASNORNA具有很多独特性，提示SNORNA在从原核生物向真核生物进化的过程中可能具有不同的进化路线。而对TINYRNA的系统研究发现，在贾第虫中存在着大量不同种类的TNCRNA，它们在基因调控中发挥着重要作用。贾第虫两类不同长度的内源性反转座子SIRNA的鉴定，表明内源性SIRNA在生物进化的早期已经发生并普遍存在于真核生物中，而且同时在转录和转录后两个水平上调控靶基因的基因沉默，这为深入研究内源性SIRNA的起源进化提供了重要的线索和依据。大量TRNADERIVEDTINYRNA在贾第虫中的首次发现和鉴定，也为研究成熟TRNA在体内的分子内剪切机制提供了重要的线索，并为进一步研究这些TINYRNA可能具有的功能奠定了基础。

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